一、瞄准领域短板，另辟蹊径研究

动物胚胎的冷冻保存技术不仅为动物种质资源的保存和良种家畜的繁殖提供有效手段,而且还是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术不可分割的重要组成部分。在动物胚胎冷冻保存过程中，抗冻保护剂发挥着举足轻重的作用。

早期的抗冻保护剂如甘油、二甲基亚砜等在冷冻过程可使得动物胚胎避免过大的冷冻损伤，在一定程度上保持其解冻后的存活状态。这些保护剂的成功应用为冷冻保护剂研究奠定了基础，但在实际应用中，此类抗冻保护剂均无法彻底规避其自身对胚胎产生的细胞毒性。近年来，动、植物源的抗冻蛋白（antifreeze protein，AFPs）在冷冻保存中所表现出的无毒性和特有的生物学特性已成为研究热点，其作用原理主要是抑制冷冻和解冻过程中胚胎细胞内外冰晶的形成和生长，从而避免低温条件对胚胎造成的损伤。

目前，对于AFPs功能机理的研究主要集中在其对冰晶形成所产生的物理影响上，极少涉及AFPs本身与胚胎细胞分子间可能产生的生物学联系和反应。学校科研团队通过研究正常孵化的小鼠囊胚和休眠胚胎在程序化冷冻前后与抗冻相关蛋白的差异表达变化，揭示了小鼠休眠胚胎在完全没有透明带保护的情况下，具有比普通正常孵化囊胚更高冷冻-解冻保护率的主要机制；同时，通过添加各自特定的(合成酶活)抑制剂，结合体外添加其各自特异编码的哺乳动物源重组蛋白，进一步探究其在提高小鼠休眠胚胎抗冻能力中的具体作用，为进一步阐明休眠胚胎独特的全新抗冻机制，以及为开发新型的哺乳动物源抗冻蛋白(抗冻保护剂)奠定了良好基础。

二、科研实现突破，弥补领域空白

近年来，团队聚焦AFPs（包括RhoA重组蛋白、含Cathepsin L的抑制剂、Clusterin蛋白）在制备提高胚胎抗冻性以及解冻后复苏率的培养液中的应用。研究发现，在小鼠正常孵化胚胎的培养液中添加体外重组RhoA蛋白、E-64d、Clusterin蛋白可显著提高正常孵化胚胎的解冻复苏率。这是RhoA重组蛋白、E-64d、Clusterin蛋白首次应用于胚胎冷冻领域的研究。通过添加体外重组蛋白以及Cathepsin L抑制剂显著提高胚胎的抗冻性以及解冻后的复苏率，有效避免了目前常用的抗冻保护剂对胚胎的细胞毒性，进一步降低了其对胚胎冷冻-解冻的不利影响。同时，团队首次针对与哺乳动物细胞膜结构相关蛋白以及冷冻前后的凋亡因子，深入解析了与提高小鼠正常孵化囊胚，尤其是小鼠休眠胚胎抗冻性之间的密切联系，为进一步阐明小鼠休眠胚胎独特的全新抗冻机制提供新思路，相关研究成果弥补了本领域的空白。

三、合理布局产权，掌握核心技术

通过在体外胚胎培养液中添加RhoA重组蛋白、一种含Cathepsin L抑制剂以及Clusterin蛋白，制备提高胚胎抗冻性以及解冻后复苏率的培养液，能够显著提高正常孵化胚胎的解冻复苏率，避免常规冻保护剂的细胞毒性，从而大幅度降低了对胚胎的不利影响。

本研究成果将极大促进我国低温生物学中有关动物胚胎高效超低温冷冻保存与复原技术的推广和应用。

知识产权情况表

发表论文清单

1. Meichao Gu, Di Liu, Hemin Ni, Xihui Sheng, Alfredo Pauciullo, Xiaolong Qi, Yunhai Liu, Yong Guo. Role of X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) in frozen and thawed dormant and normal-hatched murine blastocysts. Cryobiology, 2018, 82: 112-117.

2. Meichao Gu, Hemin Ni, Xihui Sheng, Alfredo Pauciullo, Di Liu, Yong Guo. RhoA phosphorylation mediated by Rho/RhoA-associated kinase pathway improves the anti-freezing potentiality of murine hatched and diapaused blastocysts. Scientific Reports, 2017, 7:6705.

3. Xiaolong Qi^#, Kai Xing^#, Zhen Huang, Yu Chen, Liang Wang, Lichang Zhang, Xihui Sheng, Xiangguo Wang, Hemin Ni, Yong Guo*. Comparative transcriptome analysis digs out genes related to antifreeze between fresh and frozen-thawed rooster sperm. Poultry science, 2020, 99:2841-2851.

4. 胡新宇, 邢凯, 李征, 赵志显, 常雪蕊, 齐晓龙, 盛熙晖, 王相国, 倪和民, 郭勇*. 小鼠孵化囊胚及其休眠胚胎程序化冷冻-解冻前后Mgst1基因的差异表达. 中国实验动物学报, 2020, 28(2): 175-179.  

5. 陈超磊, 芦天罡, 倪和民, 盛熙晖, 王相国, 齐晓龙, 邢凯, 刘云海, 郭勇*. 小鼠休眠胚胎与正常胚胎冻融后体内外发育潜力的比较. 中国实验动物学报, 2019, 27(2):167-172．

6. 刘迪, 倪和民, 顾美超, 卢文瑾, 盛熙晖, 齐晓龙, 王相国, 郭勇*. 程序化冷冻前后小鼠正常孵化囊胚和休眠胚胎中C3基因表达的研究. 中国畜牧兽医, 2017,44(2): 514-520.

7. 王力红, 郭勇, 翟椿东, 卢文瑾, 刘迪, 杨健, 王相国, 盛熙晖, 齐晓龙, 倪和民*. 程序化冷冻前后小鼠休眠胚胎中Apol8蛋白分布和表达. 中国农学通报, 2017,33(21):149-153.

8. 刘迪, 倪和民, 顾美超, 李征, 王力红, 盛熙晖, 齐晓龙, 王相国, 郭勇*. 程序化冷冻前后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎的Hba-α蛋白分布和差异表达. 中国实验动物学报, 2016,24(06): 579-584.

9. 顾美超, 卢天罡, 刘云海, 倪和民, 张劭俣, 翟椿东, 邢书涵, 郭勇. 冻融后小鼠休眠胚胎超微结构的变化. 中国实验动物学报, 2014 (3): 53-56.